붙임 1		[현행 양식] 위해성 평가자료 제출범위(예시)

1. 유전자변형생물체의 용도에 관한 자료

가. 개발․실험의 배경 및 목적s

개발·실험(배양)하고자 하는 유전자변형생물체(LMO)의 개발 배경 및 목적을 기술

나. 주요 용도

개발·실험(배양)하고자 하는 LMO의 용도에 대해 기술

다. 사용이 승인된 국가 및 승인 용도

- 개발·실험(배양)하고자 하는 LMO와 유사한 경우의 국외 승인여부 사례 및 용도를 기술

- LMO의 실험 사용이 승인된 현황 및 승인 용도를 기술

2. 유전자변형생물체에 관한 자료

가. 명칭

개발 예정 LMO명 (Host cell & Plasmid)		숙주	사용한 백터	도입한 유전자, bp	예상되는 특성	발현 산물
1	LM E. coli-GFP	E. coli	pET23a 6,072bp	- AmpR, 861bp - aacC1, 495 bp - gfp, 400bp	- ampicillin, - gentamicin 내성	-
3	LM E. coli -SARS-CoV-2	E. coli	pET23a 6,072bp	- SARS-CoV-2 spike protein 900bp - AmpR, 861bp - aacC1, 765bp	- ampicillin, - gentamicin 내성	spike 단백질

나. 도입유전자에 의하여 부여된 특성

대장균에 도입될 플라스미드는 GFP 유전자와 ampicillin, gentamicin 내성 유전자(AmpR, aacC1)가 도입된 형태임. LM E. coli는 AmpR에 의해 ampicillin 내성을 지니게 되며, 이를 이용하여 해당 플라스미드가 도입된 LMO만 selection 할 수 있음.

GFP 유전자에 의해 green fluorescence protein이 발현되며, 그 결과 녹색형광을 나타냄으로써 형광측정기기를 이용한 연구에 활용될 수 있음.

SARS-CoV-2 유전자는 SARS-CoV-2의 유전자 서열 일부로 바이러스와 host cell간의 막 융합에 관여하는 유전자임. 해당 유전자를 이용하여 백신 개발 연구에 이용할 수 있음.

다. 숙주 또는 근연종과의 생물학적 특성의 차이점

유전자재조합 대장균에는 형광·발광 유전자와 항생제내성 유전자가 도입될 예정임.

그러므로, LM E. coli에는 형광단백질(GFP gene)과 ampicillin, gentamicin 내성 이외에는 Escherichia coli와 동일한 생물학적 특성을 가질 것으로 예상됨.

라. 병원성, 독소 생산성, 알레르기 유발성 및 기타 유해 생리활성물질 생산가능성

도입된 유전자로 인하여, 독소 생산성, 알레르기 유발성 및 기타 유해활성 물질은 생성하지 않는 것으로 예상됨.

마. 유전자변형생물체 내 도입유전자의 위치 및 복제 수

E. coli 균주에 삽입될 pcDNA3.1 SARS-CoV-2 플라스미드 벡터는 숙주 내에서 플라스미드 형태로 존재하며 High Copy로 예상됨.

바. 유전자변형에 사용된 벡터의 특성 및 존재여부

- 명칭: pcDNA3.1 SARS-CoV-2

- 기능: HEK293T와 E. coli 내에서 모두 복제가 가능하도록 재조합된 벡터임.

- 비접합성 벡터

- 선택마커: ampicillin(E. coli), gentamicin(HEK293T)

- 프로모터: CMV, SV40, T7

- 존재여부: E. coli(중간숙주)와 HEK293T(최종숙주)는 벡터를 포함하고 있음.

사. 유전자변형생물체 및 도입유전자의 검출 및 확인방법

- PCR: 도입된 유전자와 관련된 프라이머를 이용하여 검출이 가능함.

- 항생제를 이용한 selection으로 분리가 가능함.

3. 숙주에 관한 자료

가. 명칭, 유래 및 분류학적 특성

Escherichia coli(제1위험군): 대장균은 그람 (Gram) 음성 막대균으로 인간을 포함한 온혈동물의 창자에서 많이 볼 수 있는 박테리아이로 대부분의 대장균의 변종들은 해롭지 않지만, 몇몇의 항원형이 심각한 식중독을 일으킬 수 있음. 해롭지 않은 변종들은 장내 미생물 중 일부로써 비타민 K2 등을 생산하여 도움을 주기도 하며, 창자에서 병의 원인이 되는 박테리아의 번식을 막기도 함. 대장균 세포들은 몸 밖에서 제한된 시간동안만 살아남을 수 있으므로, fecal contamination 을 테스트하는 이상적인 지표종으로 사용하고 있음.

나. 개발․실험하고자 하는 유전자변형생물체와 유사한 용도의 유전자변형생물체의 숙주로 이용된 사례

해당 연구는 ??의 OO에서 SARS-CoV-2 spike 유전자를 이용한 백신치료제 개발에 대한 연구가 진행되었음.

다. 숙주 및 근연종에서의 독소 생산성, 알레르기 유발성 및 기타 유해 생리활성물질 생산성 여부

실험에 사용될 대장균은 DNA(plasmid)를 증폭하는데 사용되는 생물체로 독성, 알레르기 유발성 등의 물질을 생산하지 않는 것으로 알려져 있음.

라. 미생물인 경우, 병원성 존재 여부 및 알려진 병원체와의 관련성

실험에 사용될 대장균은 제1위험군의 미생물로 인간을 포함한 온혈동물의 창자에서 많이 볼 수 있는 박테리아이며 병원성을 가지고 있지 않음.

4. 공여체에 관한 자료

가. 명칭, 유래 및 분류학적 특성

- SARS-CoV-2(제3 위험군): SARS-CoV-2 spike gene의 공여체. SARS-CoV-2 감염에 의한 호흡기 증후군. 법정감염병. 제1급감염병 신종감염병증후군. Coronaviridae에 속하는 RNA 바이러스로 2019년 12월 중국 우한에서 처음 발생한 이후 중국 전역과 전 세계로 확산된, 새로운 유형의 코로나바이러스(SARS-CoV-2)에 의한 호흡기 감염질환임. 잠복기는 1~14일(평균4~7일)이며, 증상은 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증까지 다양한 호흡기감염증이 나타나며, 그 외 가래, 인후통, 두통, 객혈과 오심, 설사 등도 나타남. 전세계 치명률은 약 3.4%(WHO, 3.5 기준)이며, 단, 국가별·연령별 치명률 수준은 매우 상이함. 고령, 면역기능이 저하된 환자, 기저질환을 가진 환자가 주로 중증, 사망 초래함.

※ 도입유전자는 합성하여 사용 예정이므로 공여체를 직접 취급하지 않음.

- Escherichia coli(제1위험군): AmpR의 공여체. 대장균은 그람 (Gram) 음성 막대균으로 인간을 포함한 온혈동물의 창자에서 많이 볼 수 있는 박테리아로 대부분의 대장균의 변종들은 해롭지 않지만, 몇몇의 항원형이 심각한 식중독을 일으킬 수 있음. 해롭지 않은 변종들은 장내 미생물 중 일부로써 비타민 K2 등을 생산하여 도움을 주기도 하며, 창자에서 병의 원인이 되는 박테리아의 번식을 막기도 함. 대장균 세포들은 몸 밖에서 제한된 시간동안만 살아남을 수 있으므로, fecal contamination 을 테스트하는 이상적인 지표종 으로 사용하고 있음.

- Pseudomonas aeruginosa(제2위험군): aacC1의 공여체. 녹농균. 감마프로테오박테리아의 한 종류로 그람음성, 막대균, 단극성 편모를 가지고 있어 운동성이 있음. 신체의 거의 모든 조직에 감염될 수 있음. 피부감염, 욕창, 중이염, 심내막염, 폐렴, 균혈증, 패혈증, 수막염, 뇌종양 등을 유발함.

- Aequorea victoria (jellyfish)-(제1위험군): GFP 단백질은 최초에 Aequorea victoria (jellyfish)에서 추출되었으며, 이후 높은 활용가치로 인해 여러 연구 및 실험에 널리 사용되고 있음. 일반적으로 유전자의 유지 및 증폭을 위해 플라스미드 벡터의 형태로 E. coli 내에 도입되어 유지됨.

※ 도입될 약제내성 유전자와 형광 유전자는 상업적으로 판매되는 벡터로부터 도입 예정이므로 공여체를 직접 이용하지 않음.

나. 개발․실험하고자 하는 유전자변형생물체와 유사한 용도의 유전자변형생물체의 공여체로 이용된 사례

- Escherichia coli: AmpR(ampicillin 내성 유전자)의 공여체로 다른 약제내성 유전자의 공여체로써 벡터의 selection marker로 많이 사용되고 있음.

- Pseudomonas aeruginosa: aacC1(gentamicin 내성 유전자)의 공여체로 다른 약제내성 유전자의 공여체로써 벡터의 selection marker로 많이 사용되고 있음.

SARS-CoV-2: SARS-CoV-2 spike protein을 이용하여 다양한 백신 및 치료제 개발에 사용되고 있음.

다. 공여체 및 근연종에서의 독소생산성, 알레르기 유발성 및 기타 유해 생리활성물질 생산성 여부

도입 유전자들은 공여체를 직접 사용하지 않으므로 공여체로부터 발생하는 독소 생산성, 알레르기 유발성 및 기타 유해 생리활성물질 생산성 여부 해당 사항 없음

- gfp: 벡터 내 유전자 이용

- AmpR, aacC1: 벡터 내 유전자 이용

- SARS-CoV-2 spike : 유전자 합성하여 사용

라. 미생물인 경우, 병원성 존재 여부 및 알려진 병원체와의 관련성

도입 유전자들은 공여체를 직접 사용하지 않으므로 해당 사항 없음

- gfp(Aequorea victoria-제1위험군): 벡터 내 유전자 이용

- AmpR(Escherichia coli-제1위험군): 벡터 내 유전자 이용

- aacC1(Pseudomonas aeruginosa-제2위험군): 벡터 내 유전자 이용

- SARS-CoV-2 spike(SARS-CoV-2-제3위험군): 유전자 합성하여 사용

5. 유전자재조합 특성에 관한 자료

가. 유전자변형에 사용된 현대생명공학기술 상세 실험방법

LMO를 개발하기 위하여 인위적으로 유전자를 재조합, 삽입 또는 소실하는데 이용되었거나 이용될 현대생명공학기술을 상세하게 기술

나. 벡터에 관한 자료

(1) 명칭, 기능 및 유래된 생물체

① 명칭: pcDNA3.1 SARS-CoV-2 M (회사명. cat no.??)

② 기능: 6,072bp. E. coli와 Mammalian 내에서 모두 복제가 가능하도록, 재조합된 벡터로 프로모터로는 CMV, SV40, T7을 가지며 다양한 포유류 세포에서 지속적이고 높은 발현을 보임. 항생제 내성유전자로 AmpR, aacC1가 포함되어 있으므로 대장균에서 ampicillin으로 selection이 가능하며 mammalian에서는 gentamicin으로 selection이 가능함. NCBI 검색결과 유해 서열 없음.

(2) 구성요소 및 도입유전자를 포함한 지도

- pcDNA3.1 SARS-CoV-2 M

요소	크기(bp)	종류
CMV promoter	380	promoter
T7 promoter	19	promoter
SV40 promoter	330	promoter
aacC1	495	CDS
AmpR	861	CDS

- 벡터 지도 삽입 필요

(3) 병원성, 독소 등 위해염기서열의 존재여부

- 병원성, 독소 등의 위해염기서열 포함하지 않음.

(4) 다른 생물체로의 전달 가능성 및 숙주 범위

대장균과 mammalian 이외 다른 생물체로 벡터가 전달될 가능성에 대해서는 아직 보고된 바 없음.

(5) 선발표지유전자

pcDNA3.1 SARS-CoV-2 M 벡터 내에 선발표지 유전자로 AmpR, aacC1 이 포함되어 있음. 대장균에서는 selection marker로 ampicillin을 사용함.

다. 도입유전자에 관한 자료

(1) 도입유전자의 기능 및 특성

- dsbC (GenBank: ????): 452bp, disulfide bond isomerase 표적단백질의 folding을 도와줌. 병원성, 독소의 위해염기서열 존재하지 않음.

- bla (GenBank: ????): 512bp. 대장균 Tn3 transposon에서 유래된 bla gene이 선발유전자로 사용. bla 유전자는 대장균에서 재조합단백질 발현에 광범위하게 사용되며, 암피실린 내성을 나타냄. 위해염기서열은 존재하지 않음.

- aacC1 (GenBank: ????): 495bp, gentamicin 약제내성 유전자. PubMED 및 NCBI 검색결과 유해 서열 없음.

(가) 병원성, 독성 등 위해 발현 가능성

병원성 독성 관련 유전자를 포함하지 않으므로 위해 발현 가능성 없음

(나) 독소 생산성 및 독력, 생산 독소의 생물학적 및 생화학적 특성

독소 생산 관련 유전자를 포함하지 않으므로 해당 사항 없음

(다) 약제 내성 발현성 및 교차 내성 등 특성

약제내성 유전자는 플라스미드 형태로 도입되어 발현되며, 교차 내성 가능성 없음

(라) 병원성 및 병독성, 감염대상 범위의 변이성 등 생물학적 특성

병원성을 가지는 유전자를 포함하지 않으므로 해당사항 없음

(2) 도입유전자의 크기, 명칭 및 염기서열(위해염기서열의 존재여부 포함)

- AmpR(GenBank NO. 4XZTS6HY013): 861bp. ampicillin 내성 유전자. 위해염기서열은 존재하지 않음.

- aacC1(벡터내의 유전자 이용): 495 bp. 위해염기서열은 존재하지 않음.

- gfp(GenBank NO. L29345.1): 400bp. 형광발광 유전자. green fluorescence protein이 발현되며, 녹생형광을 나타냄. 해당 유전자 내에 위해염기서열은 존재하지 않음.

SARS-CoV-2(GenBank NO. NC_045512.2): 700bp. 바이러스막에 존재하는 단백질로 Host cell의 세포 포면의 바이러스 수용체(ACE2)에 결합하여 세포내로 진입하는 필수적인 단백질임. 위해염기서열은 존재하지 않음.

(3) 조절인자 및 유전자 기능에 영향을 주는 기타 인자

벡터의 프로모터에 의해 도입유전자는 발현이 조절됨. 이 외에 도입 유전자의 발현, 기능에 영향을 주는 기타인자는 없음.

6. 안전관리에 관한 자료

가. 신청과제에 대한 기관 생물안전위원회의 생물안전심사 결과자료

- 기관생물안전위원회 승인: AAAA-IBC-2020-000

- 동물실험윤리위원회 승인: AAAA-IACUC-2020-000

나. 유전자변형생물체 취급․보관 안전관리에 관한 자료

(1) 개발·실험에 대한 위해성평가 자료

- 전제 실험에 대한 위해성평가 내용을 작성합니다.

숙주 : Escherichia coli는 제1 위험군 분류됨.

도입유전자는 병원성 및 병독성을 나타내지 않음.

본 유전자변형생물체의 개발·실험은 BL2 연구시실에서 실험을 진행함

(2) 연구시설 설치․운영 현황 (연구시설 신고 및 허가 자료 포함)

- BL2 연구시설 : ABCD-11-2-02호

- 기본적인 미생물실험을 위한 개인보호장구 및 BSC, 생물안전장비 등이 구비되어 있음.

연구시설 설치·운영 확인서 첨부

(3) 개발·실험의 안전관리수칙 및 응급조치사항 포함

LMO를 이용하는 실험 중 비의도적 사고 등으로 인하여 시험∙연구자가 LMO에 노출되거나 유전자변형생물체가 유출된 경우를 대비하기 위한 응급조치, LMO 취급에 대한 주의사항 및 위해 예방조치 등 안전관리수칙을 기술

(4) 유전자변형생물체 보관․ 표시 및 폐기 방법

1. 보관 및 폐기

실험에 사용되는 균주의 보관 및 폐기는 기관의 실험실생물안전지침에 의거하여 진행될 계획임.

2. 보관방법

개발된 LMO 보관 용기에는 LMO 명칭, 관리번호 등을 표시하고, LMO법 시행규칙 별지 제45호의2서식 [시험·연구용 등의 유전자변형생물체 취급·관리대장] LMO 정보-명칭, 숙주, 도입유전자, 공여체 등을 기록하여 관리함.

3. 폐기방법

실험에 사용된 균주 및 관련 실험재료 등은 고압증기멸균 등의 방법으로 완전히 사멸시킨 후, [폐기물관리법]에 의거한 의료폐기물 처리방법에 따라 위탁처리(OO업체)함.

(5) 개발·실험 관여 전문인력 현황

소속	성명	직위	학력	연락처	실험 경력	생물안전교육 이수여부
OOOOO	김OO*	과장	박사	043)719-0000	10년	이수
	박OO	책임연구원	박사	043)719-0001	5년	이수
	이OO	선임연구원	석사	043)719-0002	3년	이수
	최OO	연구원	석사	043)719-0003	1년	이수

* : 연구책임자

다. 유전자변형미생물의 동․식물 접종에 관한 자료(해당되는 경우)

(1) 접종 대상 동․식물의 명칭 및 생물학적 특성

(2) 실험내용 및 폐기 방법

(3) 관련 연구시설 안전관리등급 및 시설 안전관리사항